中药葛根芩连汤的抗肿瘤机制研究怎样发到Cell Death & Disease

发表期刊：Cell Death & Disease

研究内容：葛根芩连汤和抗PD-1联合治疗抑制肿瘤生长的机制

影响因子：5.959

发表时间：2019

实验方法：16S rDNA测序 + 非靶向代谢组

研究背景（图片来自网络，侵删）葛根芩连汤(Gegen Qinlian Decoction，GQD)是传统中药(TCM)的组方，临床证明对溃疡性结肠炎(UC)和2型糖尿病有良好的治疗效果。PD-1（programmed death 1）免疫治疗作为一种新型疗法在医学界备受关注，它是一类免疫治疗的药物可以促进病人自身的免疫系统杀伤肿瘤，已经被用于包括黑色素瘤、肺癌、肝癌和胃癌等十几种癌症的治疗。然而，大多数结直肠癌(CRC)病例是微卫星稳定型(MSS)，对基于抗PD -1的免疫治疗没有反应，联合治疗被认为是克服这一局限的理想策略。本文主要是探讨中药GQD和抗PD-1联合治疗抑制肿瘤生长的背后机制。

实验设计BALB/c雄性小鼠在特定的无致病性条件下适应性喂养1周，然后口服300 mg/kg(低剂量组)，1500 mg/kg(中剂量组)，7500 mg/kg GQD(高剂量组)每日1次，共10天。CT26细胞在每只小鼠左侧腋窝区皮下移植1周，造瘤。当肿瘤达到50 mm3的大小,给小白鼠腹腔注射anti-mouse PD-1 ，对照组小鼠给予等量PBS。所有小鼠每三天间隔注射5次PD-1 或PBS，在整个动物实验过程中，GQD不间断使用。阶段一分为：
低剂量GQD组(300 mg/kg)、中剂量GQD组(1500 mg/kg )、高剂量GQD组(7500 mg/kg )、对照组阶段二分为：GQD组(不同剂量)、PD-1组、GQD(不同剂量)+ PD-1组、对照组

样本类型血浆样本、粪便样本

研究结果1.    GQD粉末的高效液相色谱-质谱分析(HPLC-MS/MS)首先作者对GQD粉末中的6种主要活性成分：葛根中葛根素和大豆苷、黄连中小檗碱、黄芩中黄芩苷和汉黄芩苷、甘草中甘草苷进行定量（下图1）。关于校准曲线、线性范围和分析物含量详见表1。图1 标准曲线
表1 线性回归数据和分析物含量
2.    GQD对CRC潜在的抗肿瘤机制
接着作者开始研究GQD对CRC可能的抗肿瘤机制。GQD共含476种化学物质（取自中药医药系统药理学数据库），其中葛根中有18种，黄芩中有143种，黄连中有48种，甘草中有280种。通过口服生物利用度 (OB) 和药物相似性 (DL) 筛选，从GQD中获得138个潜在活性化合物，作为“候选化合物”。葛根、黄芩、黄连、甘草四种药材分别贡献有4、36、14、90个候选化合物。接着作者分析得到了126个候选化合物的260个潜在治疗靶点，据此绘制了GQD的化合物-潜在靶点的网络图（图2a）。为了探索GQD对CRC潜在的抗肿瘤机制，作者进一步从OMIM（http://www.omim.org/）、GAD（http://geneticassociationdb.nih.gov/）和TTD（https://db.idrblab.org/ttd/）三个数据库中确定了150个CRC相关靶点，然后构建了两个蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络：GQD化合物的潜在靶点PPI网络和CRC相关靶点的PPI网络。从这两个网络中取交集，发现79个GQD在CRC中的重要靶点（图2b）。功能注释结果发现GQD的79个重要靶点可能参与多种肿瘤的病理过程，例如CRC、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、子宫内膜癌、膀胱癌、黑色素瘤、胶质瘤等。此外，细胞周期、粘着斑、NOD样受体信号通路富集程度高（图2c）。因此，作者认为GQD通过其复杂的活性成分可能对人体的多个靶点和通路发挥治疗作用。图2 GQD在结肠癌中的潜在抗肿瘤机制3.    GQD与PD-1抗体联合治疗的体内抗肿瘤效果然后为了验证GQD是否可以与免疫治疗药物联合应用于CRC患者，作者研究了GQD与PD-1抗体联合治疗对CT26荷瘤小鼠结直肠癌生长的体内作用，分为低剂量GQD (300 mg/kg)，中剂量GQD(1500 mg/kg ), 高剂量GQD(7500 mg/kg )，PD-1, GQD (300 mg/kg) + PD-1, GQD(1500 mg/kg) + PD-1, GQD (7500 mg/kg) + PD-1组与对照组小鼠比较（图3a）。第32天的相对肿瘤体积8个组为8.704 cm³(低剂量组)，7.976 cm3(中剂量组)，6.216 cm³(高剂量组)，4.847 cm³ (PD-1组)，2.436 cm³ (GQD (300 mg/kg) + PD-1组)，3.362 cm³ (GQD (1500 mg/kg) + PD-1组)，3.305 cm³(GQD (7500 mg/kg) + PD-1组)和8.496 cm³(对照组)。结果发现与对照组相比，低剂量GQD组无明显抗肿瘤作用，PD-1组明显抑制了肿瘤的生长，GQD和PD-1联合治疗显著抑制了肿瘤的生长（图3b）。第32天的肿瘤生长抑制率(TGI) 分别为 2.450%(低剂量组)、6.125%(中剂量组)、26.836%(高剂量组)、48.216% (PD-1组)、70.526% (GQD (300 mg/kg) + PD-1组)、60.424% (GQD (1500 mg/kg/kg) + PD-1组)、60.097% (GQD (7500 mg/kg) + PD-1组)，根据TGI结果，发现高剂量GQD组的TGI显著（图3c），而低剂量GQD与PD-1抗体联合治疗组最显著。6周+32天从不同治疗组的小鼠身上收集的具有代表性的肿瘤块的照片，结果表明，GQD能增强抗PD -1免疫治疗效果，并能抑制体内CRC的肿瘤生长（图3d）。图3 GQD与抗小鼠PD-1联合治疗在体内抑制结肠癌肿瘤生长
4.    GQD调节肠道微生物组组成
接着开始研究仅使用GQD处理的小鼠肠道微生物组成，在经过6周+17天GQD处理后，在接受PD-1单抗治疗之前收集了CT26荷瘤小鼠肠道微生物组粪便样本，包括低剂量GQD组(300 mg/kg) (n = 23)和非GQD组(n = 20)样本。先评估肠道微生物组的组成，比较低剂量GQD组和非GQD组之间两个群落的物种多样性情况（图4a）。PCA分析表明，低剂量GQD组与非GQD组的微生物群落结构没有明显的分离（图4b），低剂量GQD组与非GQD组的肠道菌群alpha多样性在Ace、Chao、Shannon等指标上无显著差异。作者发现，s__unclassified_f__Erysipelotrichaceae，s__Lactobacillus_murinus_g__Lactobacillus和s__unclassified_g__Parasutterella在低剂量GQD组富集，s__unculture-d_organism_g__norank_f__Peptococcaceae，s__unculture-d_bacterium_g__Oscillibacter，和s__uncultured_bacterium_g__Tyzzerella在非GQD组富集（图4c）。作者接着进行了LEfSe差异分析，进一步查看低剂量GQD组和非GQD组的粪便菌群中有哪些差异，发现GQD组富集Erysipelotrichaceae，非GQD组富集Peptococcaceae和Bacteroidales_S24_7_group（图4d,e）图4 GQD调节肠道微生物组组成
5.    GQD持续调节肠道菌群，增强PD-1抗体的抗肿瘤活性
接着开始研究PD-1免疫治疗对肠道菌群的影响，并探讨是否与GQD处理有关。作者收集了免疫治疗结束时(6周+ 32天)CT26荷瘤小鼠的肠道微生物组样本，包括低剂量GQD + PD-1组、低剂量GQD组、PD-1组和对照组。4个组的肠道菌群是相对多样的，在GQD和GQD + PD-1联合治疗组中均有较高丰度的g__Bacteroides，PD-1组和对照组含量较高丰度的g__norank_f__Bacteroidales_S24-7_group（图5a）。PCA结果显示了这4个组的肠道菌群具有显著的聚类效应（图5b）。基于Ace、Chao和Shannon指数，低剂量GQD组的肠道微生物群落的alpha多样性明显低于其他三组（图5c-e）。在物种水平上比较GQD + PD-1联合治疗组和对照组，发现联合治疗组s__Bacteroides_acidifaciens和s__uncultured_organism_g__norank_f__Bacte roidales_S24-7_group出现富集，对照组则富集到s__uncultured_bacterium_g__norank_f__Bacteroidales_S24-7_group和s__uncultured_Bacteroidales_bacterium_g__norank_f__Bacteroidales_S24-7_group（图5f）。图5 GQD + 抗PD-1联合治疗对肠道菌群的影响
6.    GQD和抗PD-1联合治疗可引起血脂和代谢组的特异性改变

得到了联合治疗对肠道菌群的影响后，开始对代谢组学进行探究。在免疫治疗后(6周+ 32天)，作者对同批小鼠的血浆进行了UPLC-MS 代谢组分析（包括低剂量GQD + PD-1组、低剂量GQD组、PD-1组和对照组）。PCA结果显示，QC样品在评分图中紧密聚集，表明分析方法具有良好的数据质量和重现性，并且四组间代谢物的分布存在显著差异(图6a, b)。

在GQD vs.对照组，PD-1 vs.对照组，和GQD + PD-1 vs.对照组中，分别发现391、308、322个代谢物有显著差异。根据通路富集结果揭示了血浆代谢物功能。GQD 组与对照组比较，显著富集的通路是鞘脂类代谢通路（图6c）；PD-1组与对照组相比，显著富集的通路是鞘磷脂代谢和甘油磷脂代谢通路（图6d）；比较GQD + PD-1联合治疗组与对照组血浆代谢物的富集通路是鞘脂代谢和甘油磷脂代谢通路（图6e）。统计GQD 组与对照组，PD-1组与对照组，以及GQD + PD-1联合治疗组与对照组的共有和特有差异代谢物绘制韦恩图（图6f)，GQD + PD-1组与对照组比较中有158个特异的代谢物，并进行了通路富集分析（图6g)。接下来，作者探讨特定的代谢物如何影响抗PD-1免疫治疗效果。使用33种代谢物进行监督分层聚类，这些代谢物是GQD + PD-1组 vs. 对照组和PD-1组 vs. 对照组中共有的，但在GQD组 vs. 对照组中不存在（图6h）。关注到在GQD+ PD-1组中丰度较高的一组代谢物，包括LysoPC(20:3(5Z,8Z,11Z))，vignatic acid B，LysoPE(0:0/22:4(7Z,10Z,13Z,16Z))，LysoPE(0:0/20:2(11Z,14Z)) 和PI(20:4(8Z,11Z,14Z,17Z)/16:0)，也关注到在该组中丰度较低的一组代谢物包括(1aS,5R,6R,9aR)-6-{[2,6-dideoxy-2-(methylamino)，isopeonidin 3-rutinoside，glycerol 2-(9Z,12Z-octadecadienoate)，tetraethylene glycol和 pentadecanoylglycine。图6 GQD+抗PD-1联合治疗可引起血脂和代谢组的特异性改变
7.    GQD与PD-1抗体联合治疗增强抗肿瘤免疫
对荷瘤小鼠外周血淋巴细胞进行染色，并采用流式细胞术分析全身免疫反应，发现GQD和PD-1联合治疗组外周血淋巴细胞中CD8⁺T细胞比例明显高于对照组(图7a, b)，同时高于PD-1治疗组。在临床前模型中有明确的证据表明，肿瘤微环境的改变与抗PD-1治疗的反应密切相关。作者接下来通过免疫组化和免疫荧光检测了GQD和PD-1联合治疗后肿瘤组织中肿瘤相关免疫细胞的浸润情况，发现与对照组相比在联合治疗后可以观察到更高密度的CD8⁺T细胞，与上述结果一致（图7c-e）。ELISA结果显示，经GQD和抗PD-1联合治疗后，小鼠的PD-1和CD4水平较低，小鼠有更高的水平IL-2和IFN-γ- 2 ，而TGF-β、CD8、IL - 6和IL - 17没有显著变化(图7f)。图7 GQD与抗PD-1联合治疗可增强全身免疫和抗肿瘤免疫

结论本文通过药理学研究表明，GQD在人体中通过多种靶点和途径发挥作用。GQD联合PD-1抗体能有效抑制结直肠癌的生长。肠道菌群分析显示，GQD和PD-1联合治疗组可显著丰富肠道菌群，根据代谢组学分析，在联合治疗组中也发现了变化明显的代谢物，及显著富集的甘油磷脂代谢和鞘磷脂代谢通路。此外还发现GQD和PD-1抗体联合治疗显著增加了外周血和肿瘤组织中CD8⁺T细胞的比例，GQD与PD-1抗体直接处理可提高其表达IFN-γ,这是抗肿瘤免疫治疗的一个关键因素。此外，GQD与PD-1抗体联合治疗可降低PD-1水平，增加IL-2水平，表明联合治疗可通过抑制免疫检查点，有效恢复T细胞功能。将中药配方GQD与PD-1进行联合治疗，可作为治疗多发性肿瘤CRC患者的一种新策略。编者说中药研究是我们的特色研究。根据中医理论，中药通常都为复方。然而由于是复方，难以从中找到单一的药物有效成分，因此基于中药的研究发现容易受到质疑。本研究发表在Nature旗下《Cell Death & Disease》上，其中的中药研究思路值得借鉴。首先作者抓住多个研究热点，肿瘤免疫治疗、免疫微环境、肠道菌群，又结合我们的特色——中药，其次从药理学、化合物潜在作用靶点、动物实验等多个角度证明GQD+抗PD-1联合治疗CRC具有显著效果。肠道菌群是中药作用人体的重要靶点，本研究对肠道菌群和血浆代谢物在GQD和GQD+抗PD-1联合治疗时的变化做了细致讨论，并结合肿瘤微环境的变化，阐释了GQD+抗PD-1联合治疗抗肿瘤的潜在机制。
参考文献：
Lv J, Jia Y, Li J, et al. Gegen Qinlian decoction enhances the effect of PD-1 blockade in colorectal cancer with microsatellite stability by remodelling the gut microbiota and the tumour microenvironment. Cell Death Dis. 2019. 10(6):415.相关阅读中药女贞子通过调节肠道菌群多样性来保护骨质 | 微生物专题
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